如何设计突变引物,设计突变引物时为什么一般要以突变的剪辑为中心

求助做过点突变的亲,质粒中目的片段的点突变引物设计问题

1、做过点突变的亲，质粒中目的片段的点突变引物设计问题 质粒和PCR产物需要拿去测序有2个目的，一是验证插入序列的DNA序列是否无误。第二是看插入的方向和位置是否正确。如果做定量PCR用到质粒的话，一般是用来做标准曲线的。

2、通过多聚酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是有利的），包括碱基对的增添、缺失和替换等。定点突变能迅速，高效地改变DNA所表达的目的蛋白，从而影响生物性状，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

3、引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

4、碱基发生不互补的时候需要考虑该碱基所在位置，一般来说越靠近3-端，引物与模板的匹配难度越大，容易降低扩增效率。但是靠近5-端时影响会减小。

蛋白质工程中定点突变技术的原理及流程

蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。

一）、基因定点突变 是指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程。（二）、蛋白质设计 依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立，按照蛋白质构效关系的理论基础，设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。

蛋白质工程的一般流程可以分为以下步骤：选择目标蛋白质：选择需要改良的蛋白质以及需要改良的性质，为后续的蛋白质改良设计和筛选提供方向和目标。

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

．2 定点突变技术 目前，在蛋白质工程中最常采用的技术是定点诱变技术，即在特定的位点改变基因上核苷酸的种类，从而达到改变蛋白质性状的目的。

它的原理是利用通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。第三个是细胞工程。

怎么设计引物

引物3’端的碱基一般不用A。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

引物设计原则 长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度（74度），从而降低产物的特异性。

引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

网址引物设计和验证的推荐网站为：Primer-Blast。这是一个专门设计用于在已知序列上设计引物或探针的工具。

引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。

怎么构建突变体的PCR引物?

1、方法/步骤 首先打开NCBI，选择“Nucleotide”，并在搜索框输入基因名。一般用目标基因的突变体1去设计引物，也就是要选择目标基因的“transcriptvariant1，mRNA”，没有1就用3，以此类推。

2、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

3、可以使用oligo6或者primer5等软件设计。用这些软件选择引物，主要就是看引物的稳定性，形成二聚体的可能性，退火温度等等参数。如果你的序列同源性不高，GC含量也还可以的话，可以使用一些经验性原则。

4、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

重叠延伸PCR缺失突变引物的设计

引物设计 重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。

一般建议为了方便，inner引物直接根据目标序列来设计引物（和普通PCR引物设计方式一样），而outer引物则从目标序列前后两端的序列开始设计，也就是说上下游各往前后移动一些碱基开始设计引物。

另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。

PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：PCR的技术的主要步骤：DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

引物设计原则长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度（74度），从而降低产物的特异性。

标签：引物突变设计剪辑一般